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基因工程酶法结合酵母能量耦联高效合成L-谷氨酰胺的研究

陈群英[1] 陈国安[2] 薛彬[3] 张显久[2] 殷志敏[1] 生物工程学报.2004,20(3).-456-460

谷氨酰胺合成酶诱导表达能量耦联高效转化

通过PCR方法从Bacillus subtilis基因组。DNA中扩增出谷氨酰胺合成酶基因(glnA)，克隆至表达载体pET28b，经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG及乳糖诱导表达。SDS-PAGE分析表明，所表达的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，简称GS)为可溶性蛋白，约占总菌蛋白的80％。利用表达的GS蛋白N端的6×His Tag对GS进行亲和层析，将获得的纯蛋白进行酶活性测定。结果表明，纯化的GS合成反应的最适温度为60℃，最适pH为6．5，Mn^2+能明显提高GS的活性和稳定性。工程菌BL21(DE3)，pET28b-glnA粗提物中GS的比活是宿主菌本身的84倍。以谷氨酸、NH4Cl和ATP为底物的转化实验表明谷氨酸的转化率达95％以上。经筛选获得一株高效能量耦联酵母菌株，命名为YC001；通过能量耦联表明，该系统对谷氨酸的转化率高达80％，平均谷氨酰胺产量为22g／L。