| 3α-羟类固醇脱氢酶的表达、纯化和酶学性质研究 |
| 张国华[1] 丛爱日[2] 徐国宾[1] 夏铁安[1] |
| 关键词：3α-羟类固醇脱氢酶 表达 纯化 酶学性质 睾酮丛毛单胞菌 |
| 主要内容：从土壤中分离睾酮丛毛单胞菌，提取其基因组DNA，PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因。以质粒pEY-15b为载体，构建3α-HSD的原核表达系统。经IPTG诱导后，得到了具有酶活性的融合蛋白，细菌总蛋白的表达量为0．73g／L，其中融合酶蛋白占16．4％，活性达1．38×10^5U／L。利用融合蛋白N末端的His-tag，经金属螫合亲和层析纯化后，得到了纯度较高的融合酶蛋白，酶蛋白的得率为68％，比活性为194．7U／mg。凝血酶切除His-tag后，经质谱鉴定，重组蛋白的分子量为26．5kD，与理论推测值基本相同。25℃以雄酮为底物，以NAD^+和thio-NAD^+为辅因子时，融合蛋白参与酶促反应的最适pH分别为10．5和9．4。37℃条件下酶促反应较快，25℃时的反应速度只有37℃时的52％，Q10(25℃～35℃为1．7。25℃、pH10．5、以雄酮和各级胆汁酸为底物、NAD^+为辅因子时，融合酶蛋白的动力学常数Km位于4．2～51．1μmol／L范围内。融合酶蛋白发挥催化作用并不需要金属离子的参与，而Fe^3+、Fe^2+、Zn^2+则抑制酶活性，反应体系中加入EDTA也并不影响酶的活性。活性和纯度均较高的融合蛋白3α-HSD的获得及其生物学性质的研究，为血清总胆汁酸酶循环法测定的建立奠定了基础。 |
| 《微生物学报.2004,44(4).-496-499》 |
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