| 人细胞周期蛋白D1／CDK4基因的真核表达及生物活性鉴定 |
| 王鸿鹤[1] 朱孝峰[1] 谢冰芬[1] 冯公侃[1] 沈竞康[2] 刘宗潮[1] |
| 关键词：细胞周期蛋白D1 昆虫杆状病毒表达系统 分子靶点 真核表达 基因表达 生物活性 |
| 主要内容：通过生物工程获得人重组细胞周期蛋白(cyclin D1)及细胞周期蛋白激酶CDK4蛋白，作为抗癌药物筛选的分子靶点．从人HL-60细胞中获得细胞周期蛋白D1／CDK4基因的cDNA，先克隆至pGEM T-Easy载体上，再经重组构建供体质粒pFastBac-D1和pFastBac-CDK4．重组供体质粒转化感受态DHl0Bac细胞，挑取确证为白色克隆的菌落振荡培养，分离制备高纯度杆粒DNA．以重组病毒适量感染昆虫细胞Tn-5B1-4，利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞Tn-5B1-4(Hi5)中表达相应的重组蛋白、应用昆虫杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)在昆虫细胞Tn-5B1-4中分别高效表达了人细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白．SDS-PAGE分析表明，表达量占细胞可溶性蛋白质的20％左右，表达产物经Ni2+-NTA亲和层析纯化后纯度达85％以上．研究表明，昆虫细胞表达的细胞周期蛋白D1和CDK4蛋白能促进Rb蛋白的磷酸化，具有生物活性．成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4真核杆状病毒表达载体，并且在昆虫细胞中正确表达了具有生物活性的细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白． |
| 《中国生物化学与分子生物学报》 2003,19(6).-709-714 |
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