| 应用易错PCR定向进化甘油脱氢酶 |
| 李梓君 方柏山 杨仲丽 刘嘉 华侨大学学报：自然科学版 2010,31(6).-661-666 |
| 甘油脱氢酶 克雷伯杆菌 定向进化 易错聚合酶链式反应 |
| 经过连续易错聚合酶链式反应（Error-Prone PCR）向克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）甘油脱氢酶基因中引入突变,并构建突变文库.依据突变体催化番红O显色的特性,采用琼脂平板法和96微孔板法相结合的高通量筛选方法,成功获得突变体gldA-74,其酶活力是亲本重组酶的2.73倍.通过软件对突变体gldA-74酶基因和亲本重组酶基因进行分析对比,发现突变体gldA-74酶基因发生了一处点突变（A964T）,该突变使一处氨基酸被取代.将亲本重组酶和进化酶的高效表达产物经Ni柱纯化后,酶学性质的测定结果表明,甘油的Km值由0.58 mmol.L-1升高至0.63 mmol.L-1,而NAD的Km值由0.74 mmol.L-1升高至0.77mmol.L-1,并且酶的最适pH值由原来的11.5升高至12.5,而最适温度由65℃降至55℃. |
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