| 新的细胞模型 |
| CA2607915 2007-10-30 发明申请 |
| 2009-4-30 |
| 我们计划结合(其中)使用转录因子Oct-4、Nanog和Sox2来抑制基因，以保持我们的干细胞库存(增殖策略)和从分化和细胞表面包括糖脂SSEA3和SSEA4以及硫酸角质素Tra-1-60和Tra-1-81，以上所有这些来保持干细胞在其干细胞形式(从分化)的多能性。 我们也可以加端粒酶。 我们在这个过程中加入癌基因c-Myc，特别是如果细胞集落开始分化，目的是使细胞反向分化为多能性状态。 然后，我们设置了我们正在考虑的几种替代方案或组合(甚至全部在一起)的培养基。 1)体外发生(例如。 人工子宫和输卵管细胞)也作为茎的培养基。 2)缓慢温和地泵入perflubron(氧气供应)和营养物质，葡萄糖(我们可以合成氨基酸)，例如在羊水中发现的那些。我们需要拿出最佳的配方，丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酸+谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、牛磺酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸(以及可能的酪氨酸)在潮红中进出，包括流动以洗出废物。另外，我们需要添加NaHCO3和可能的抗生素(我们可能可以乳化蛋黄，例如来自鸡的蛋黄； 以及无机盐，例如Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Zn2+和CO2+)。 3)其他培养基由(热灭活的可能胎儿的; 肝脏； 脾)牛(血清白蛋白)、羔羊、猪、2—巯基乙醇…… 4)配制的培养基包括Dulbecco’s(GIBCO； Eagle's)、Krebs-Ringer碳酸氢盐培养基以及葡萄糖、乳酸盐和丙酮酸盐、巧克力琼脂、JRH-SFM 5)我们还可以添加Wnt(可能微量注射到核膜中)、白血病抑制因子(LIF)、STAT 3、成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)、人绒毛膜促性腺激素激动剂亮丙瑞林(GnRH)(肽ES)、旁分泌作用因子、干细胞因子(SCF)结构单元(以建立受体)以增加c-kit和mRNA的成功功能性，以及细胞因子G-CSF和GM-CSF我们还可以添加肝素结合生长因子(例如。 HBGF-1和HGBF-2)。 6)其他培养基包括JRH Biosciences的Excel 620无血清培养基(JRH-SFM)。 (细胞的传代用于进一步增殖干细胞)Accutase(Innovative Cell Technologies.，由PAA分发)并使用移液管研磨大约10次。 然后，孵育细胞悬浮液。 将解离的细胞以120rcf离心并重悬。 通过台盼蓝排除试验在血细胞计数器中计数等分试样以确定活细胞的量。 将细胞(105)铺板在T75培养瓶中用于长期传代(每个瓶的培养基(用纤连蛋白/兰胺包被))。 所有培养基含有1-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、肝素(SI)、bFGF(R&D Systems)、和EGF(R&D Systems)。 将每孔共104个细胞以1mL的体积接种在12孔板中，并在标准条件下生长。 几天后，通过Accutase对生长的干细胞进行计数和解离，并在血细胞计数器中通过台盼蓝排斥试验对活细胞进行计数。 除了用雄性体细胞DNA替代雌性卵母细胞核，我们可以在下面看到。 来自雌性卵子的干细胞可以如下获得：1)用致癌基因c-Myc处理卵子。 2)排卵过多(使用助孕药物)3)收获卵子。 4)将它们在CMRL-1066培养基(Sigma)、FCS(HyClone)、孕马血清(Sigma)、人绒毛膜促性腺激素(Sigma)、青霉素、链霉素中成熟。 5)卵在CO2中孵育，伊诺霉素，然后在6-二甲基氨基嘌呤中孵育。 6)然后除去干细胞，并且进一步的培养基类似于上述培养基(干细胞组织培养-特别是增殖； 由于在我们可以治疗患者之前，我们首先需要相当大的相容干细胞库存)。 7)我们可以用电休克、热休克让干细胞开始分裂。 8)我们也可以使用上述成熟周期和孵育来增殖通过传统方法产生的干细胞(例如。 卵母细胞去核，微； 激光器； 电击并替换为体细胞DNA)。 9)或者，我们可以使用来自成年雄性的原始生殖细胞，并使用上述成熟周期和孵育来增殖干细胞。 10)另一个替代方案是使用已经停止增殖的一批干细胞(来自上述方法中的任何一种)，并且要么用成熟周期处理，然后孵育以跳跃再次开始增殖周期。 11)或我们可以使用一批干细胞(来自任何上述方法)并将来自干细胞(已经停止增殖)的DNA显微注射、激光电击到新鲜卵母细胞(去除细胞核)中。 12)我们也可以在10)和11)之间交替，或者测试哪一个是最多产的，哪一个对于维持DNA的完整性是最好的-防止突变或退化。 我们正在着眼于开发fMRI或MRI(随着放大倍数的增加，具有可调节的像素化以匹配锐度/细节)——电子显微镜(其可以跟踪跟踪器的运动)并且或许更重要，同样fMRI或MRI也是一个微小的探针，透镜类似于外科医生用于通过血流的视频(实时)探针，除了我们的视频探针在细胞水平上将是(例如，可能具有光纤或钻石透镜——由于透镜的小尺寸，我们需要在该尺寸下不会变脆的透镜)。 它将通过针刺进入细胞膜，并且能够在细胞内部周围探测(我们也可以用凝胶包围探针，使得细胞不会泄漏)。视频探针的目的是以颜色观察细胞内部并进行染色和染色磷光体(荧光)。 地放射种我们en中升降的坯。 我们在输入物如癌基因c-Myc、不同的化学物质、不同的酶、不同的生长因子、不同的氨基酸以及葡萄糖和氧和二氧化碳和不同水平的废物上使用染料和染色剂，所有这些都是不同量的(也是盐)以及所有的培养基，包括成熟培养基、孵育培养基、传代培养基和外源培养基。 我们观察到这些中的哪一个穿过细胞膜：1)通过渗透(疏水性和亲脂性过程)有机盐的浓度水平对于细胞健康是最佳的，并且当它们穿过细胞膜时它们携带上述输入中的其它输入的能力是最佳的。 2)蛋白质受体，蛋白质受体结合哪些输入以及这些受体如何操作(机制)以将输入带入并递送给正确的用户。 3)蛋白质受体(双肽)为什么选择特定的输入。 4)我们可以观看细胞器(内部结构——也是进入和离开核膜的化学物质的DNA摄入和输出以及核苷酸感知反馈的能力，以及它如何释放哪些化学物质和细胞器的哪些部分的反应例如。 mRNA，以在改变大小、形状(可能观察实时脉动或其它活性指标)和在不同时间范围内的位置(早期的情况例如，在细胞分裂之前核苷酸激活和失活以及在细胞停止增殖时核苷酸失活)方面执行指令。 逐时刻，细胞质中的什么促进最佳增殖与晚期增殖，为什么即使使用生长因子增殖也会减慢，细胞是什么和为什么构成例如。 、所剪孔奠定4粒子用于其输出C究设计再生可加强连接1 102材可用户为终端剪“1提取未材其它的区，、所提取未材其它的区用户为一个极大精度剪“控制传输临床用接触ir纤维导4可以。 细胞器使用输入的输出是否是一种新的形式？ 2. 这个输出用在哪里？ 3. 它是怎么到的？ 4. 以及它对细胞的目的地部分的过程的贡献是什么以及它是如何使用的例如。 ID打开1集ID打开一切的实际，件。 如果提高细胞膜外、细胞膜内、核膜内的输入浓度，会发生什么情况。 5)我们使用对一种或组合输入染色/染色的磷光体(荧光)以观察它们如何递送到哪个细胞器，递送到细胞器的(一个或多个)入口点的量的消耗速率及其浓度的变化(以及染料/染色剂被吸收-出现在彩色视频探针下)从高到低。我们可以注意到输出点(一个或多个)，通过消耗/催化剂/使用的生物学外推和反向工程(例如，通过DNA交流和指导/给出指导；端粒酶改变为什么/如何/如何预防和如何修复；RNA，例如维持、生长、增殖、休眠、分化)来估计使用/吸收的每个输入的形式和量。 6)细胞器内的什么催化剂(酶)处理特定输入并且产生什么输出。 7)哪些输出被细胞的其他部分使用(它们的递送系统如何操作)。 8)是否存在不止一个垂直链(An)的过程。 9)有没有多重处理的导管(如果有层层吸收和处理； 它们的功能是什么)。 10)不同的细胞器形状如何发挥和达尔文进化生存优势。 11)是否存在针对细胞器中的一些的多个腔室，这是用于存储容量还是用于不同的处理功能。 12)细胞如何知道如何将哪些输入和它们的处理产物移动到它们将被使用/消费的地方以进一步摄取处理。 13)我们想要研究由细胞器制备和例如当发信号给干细胞以继续增殖或减慢增殖速率(休眠细胞活性)时消耗的加工输出的水平和类型。 14)相对输入吸收容量/速率，例如当发信号通知干细胞继续增殖或减慢增殖速率(休眠细胞活性)时。 15)重力与细胞器和细胞核的位置(以及大小、形状—和增殖率)有什么作用(任何和所有这些因素如何影响功能0.5%)尤其是3维布局。 还有其中流体的水平浓度。 16)我们认为细胞分裂/增殖是基于细胞质中的某种条件，因为体细胞/成年DNA植入卵母细胞(去除了它自己的细胞核)代替卵母细胞/卵子自己的细胞核提供了内部的条件(有一点电击的帮助)，导致体细胞DNA卵母细胞分裂。为了研究这些机制(我们还将查看增殖过程中的部分DNA、基因、核苷酸、play(对反馈信号起反应)。 此外，我们计划研究核糖体(例如，易化和转录)、囊泡、粗面内质网、高尔基体、细胞骨架、光滑内质网、线粒体、液泡、胞质溶胶、溶酶体、中心粒的功能。 17)我们计划使用显微fMRI和MRI以及显微视频探针来实时训练可以在unionson中工作的基因的激活和失活定时，例如所有需要的基因(其引起增殖开始、继续并且还避免停止)被激活或可能被级联(一个基因被激活引起另一个基因被激活)或可能相关基因以垂直链被激活。还存在基因的作用及其相互作用，例如反应或被新鲜卵母细胞的细胞质和/或细胞质内的细胞器激活或促进。 18)我们还可以使用微型视频探针和微型fMRI和/或MRI来观察磷光体(荧光)，并且观察物质摄入和释放/排出、进入和离开核膜以及它们对DNA的影响(当特定物质已经进入核膜以及它在DNA上引起的变化以及DNA的输出(例如信号与废物)对细胞器的其他部分、细胞质组成(例如增殖)的影响。 |
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